序号

物资

名称

工作内容、检测项及质量标准

1

微生物组学（16S测序）

一．概况

对肺组织样本（包括癌组织和癌旁组织）进行DNA抽提以及16S测序。

二．方案要求

1) 测序方案：PE250；

2) 数据量：平均每个样品测序后，产生的拼接数据量≥50,000 raw tags；

3) 测序质量标准：过滤后获得的有效数据在Q30水平的碱基占总体碱基的比例≥80%；在Q20水平的碱基占总体碱基的比例≥85%；

4) 比选文件中提供测序平台及测序方案；

5) 生物信息分析：标准分析+个性化分析；

6) 结果交付：原始数据+结题报告+结果文件，40个工作日内交付所有结果（含数据分析）。

三．服务内容

对每对组织样品DNA进行抽提，并用Nanodrop、qubit和琼脂糖凝胶电泳对样品DNA进行定量和质量检测，对DNA样本进行16S rRNA基因V3-V4区PCR扩增，构建PE300文库上机测序，提供基于16S rRNA基因序列测定的微生物多样性数据分析服务。

四．分析内容

包括基本分析和模块分析，其中模块分析可以根据要求对需要研究的样品组织进行物种组成分析、alpha多样性分析、beta多样性分析和差异分析。

1) 原始数据质控，包括测序结果文件格式说明、数据处理与质量控制；

2) OTU基础分析，包括OTU及丰度分析、OTU统计、OTU Venn图分析、Core-Pan OTU 花瓣图分析、OTU PCA分析和OTU PLS-DA分析等；

3) 物种组成分析，包括门纲目科属等分类学水平物种注释、物种相对丰度柱状图展示、优势物种heatmap图、组间物种venn图等；

4) α-多样性分析，包括Simpson、Shannon、Chao、Ace等多样性指数分析、稀释曲线、Shannon-Wiener曲线、Rank Abundance曲线、箱线图等；

5) β-多样性分析，包括物种累积曲线、基于Bray-curtis/(Un)weighted Unifrac距离的NMDS分析、(3D-)PCA/PCoA分析等；

6) 差异分析，包括Adonis分析、AONSIM相似性分析、Wilcoxon秩和检验、LEfSe分析、差异物种heatmap图等；

7) 功能预测分析，COG/KEGG功能预测分析等；

8) 多组间比较差异分析及两组间比较差异分析等。

五．结果交付要求

数据交付需提供完整的实验报告，具体包括：

1) DNA质检报告：所有检测样本的检测方法、DNA浓度等检测结果和电泳检测图；

2) PCR扩增结果报告：所有检测样本PCR扩增实验条件、结果和电泳检测图；

3) 项目原始数据raw reads及经数据过滤等预处理操作后的clean reads文件；

4) 多余组织样本和提取物需返回给比选方；

5) 承诺：不瞒报、谎报、漏报检测数据、结果等信息；承担保密义务，不得泄露、擅自使用或对外发布检测结果和相关信息，严格遵守国家法律、法规和有关纪律要求。

2

全外显子测序

一．概况

对肺组织样本（包括癌组织和癌旁组织）进行DNA抽提以及外显子捕获检测服务。

二．方案要求

1) 测序策略：PE150；

2) 文库类型：人外显子文库；

3) 捕获探针：Agilent Sureselect Human Exome V6探针或IDT探针；

4) 测序数据量分配

癌组织：平均样本测序数据量（Raw Data）≥20G (平均测序深度≥200×)

癌旁组织：平均样本测序数据量（Raw Data）≥10G (平均测序深度≥100×)

5) 测序质量标准：过滤后Q20>90%，Q30>80%；碱基类型分布均匀，无GC分离；外显子区域的精准覆盖率（>10X）不低于90%；

6) 生物信息分析：标准分析+个性化分析；

7) 结果交付：原始数据+结题报告+结果文件，40个工作日内交付所有结果（含数据分析）；

8) 比选文件中提供测序平台及测序方案。

三．服务内容

对DNA 样本进行质量检测，包括 Qubit 和电泳检测，条带清晰，无RNA污染，无蛋白污染。DNA和文库质控合格后，进行全外显子检测，提供全外显子数据分析服务。

四．分析内容

原始数据质控

1) 测序数据质量评估（原始序列数据、测序数据过滤、测序错误率分布检查、测序数据质量分布等）；

2) 测序深度、覆盖度统计；

3) 体细胞变异检测（SNV检测结果、CNV检测结果、SV检测结果、Indel检测结果、mutation结果注释等）；

4) 突变位点分布情况分析；

5) 驱动基因分析；

6) CNV分布与高频CNV分析；

7) 杂合性缺失（LOH）分析；

8) 肿瘤纯度及染色体倍性分析；

9) 基因组Circos图展示；

10) 易感基因筛查；

11) NMF突变频谱和突变特征分析；

12) 高频突变基因统计及通路富集分析；

13) 突变结果癌症相关数据库注释等。

五． 结果交付要求

数据交付需提供完整的实验报告，具体包括：

1) DNA质检报告：所有检测样本的浓度、纯度相关参数和电泳图；

2) 实验文件：实验操作流程、常用软件、技术文档、注释文件；

3) 外显子捕获测序报告：提供样本质检报告、外显子捕获测序比对报告（每个样本与基因组比对的数据）、SNV、InDel、CNV(外显子捕获测序变异检测结果)等质控信息；

4) 实验数据报告：原始数据和bam文件、fastq数据等；

5) 多余组织样本和提取物需返回给比选方；

6) 承诺：不瞒报、谎报、漏报检测数据、结果等信息；承担保密义务，不得泄露、擅自使用或对外发布检测结果和相关信息，严格遵守国家法律、法规和有关纪律要求。

3

全基因组甲基化测序

一．概况

对肺组织样本（包括癌组织和癌旁组织）进行全基因组甲基化测序。

二．方案要求（甲基化芯片技术或甲基化高通量测序技术方案二选一）

基于Illumina的甲基化芯片Infinium MethylationEPIC BeadChip（简称850k芯片）检测服务，具体参数如下：

1) 平台：Illumina iScan芯片平台；

2) 芯片规格：8x芯片；

3) 覆盖区域：检测>853,000个CpG 位点，全面覆盖CpG岛、启动子、编码区、开放染色质和增强子。此外还包括 CpG 岛外的 CpG 位点，已知 DMR 位点，脱氧核糖核酸酶超敏位点以及 miRNA 启动子区域；

4) 服务要求：40个工作日内交付所有结果（含数据分析）；

5) 结果交付：原始数据+结题报告+结果文件。

基于测序平台的全基因组甲基化测序检测服务，具体参数如下：

1) 全基因组甲基化测序：平均样本测序数据量（Raw Data）≥90G，平均测序深度≥30X；

2) 测序策略：PE150；

3) 测序质量标准：过滤后获得的有效数据Q20>90%，Q30>80%；

4) Bisulfite转换效率或对应参数：甲基转化率不低于99%；

5) 结果交付：原始数据+结题报告+结果文件；

6) 项目周期：40个工作日内交付所有结果（含数据分析）；

7) 比选文件中提供测序平台及项目方案。

三．样本要求和质检

样本处理：

1) 组织DNA抽提使用《DNeasy Blood&Tissue Kit》Qiagen Cat. No.69506；

2) DNA定量/质检，出具质检报告：

3) DNA质检使用Nanodrop/qubit和琼脂糖凝胶电泳评估样本质量和总量；

4) 亚硫酸盐转化：Bisulfite转化使用Zymo《EZ DNA Methylation Kit》，操作步骤严格遵守厂商说明书进行。基于其他方法转化请提交详细说明。

四．分析内容

850K分析包括：

1) 原始数据IDAT文件

2) 原始甲基化水平数据导出

3) 归一化甲基化水平导出

4) 样品相关性分析

5) 主成分分析

6) 差异甲基化位点（DMP）分析

7) 差异甲基化位点的数目统计

8) 差异甲基化位点的分布分析

9) 差异甲基化位点的聚类分析

10) 差异甲基化位点所在基因的功能注释

11) Gene ontology功能注释

12) Pathway注释

13) Disease注释

14) 差异甲基化位点所在基因的富集分析

15) Gene ontology功能富集分析

16) Gene ontology富集层次图

17) Pathway富集分析

18) KEGG pathway图

19) Disease富集分析

20) 差异甲基化区域（DMR）分析

21) 差异区域筛选

22) 差异区域信息注释

23) 差异区域聚类分析

24) 差异区域基因的功能注释

25) GO（Gene ontology）功能注释

26) Pathway注释

27) Disease注释

28) 差异区域基因的富集分析

29) GO（Gene ontology）功能富集分析

30) GO（Gene ontology）富集层次图

31) Pathway富集分析

32) KEGG pathway图

33) Disease富集分析

五．预实验要求及质量控制

1) 中选后，中选人对10对样品进行预实验，质检通过后且经采购人审核确认后，启动后续检测流程；

2) 中选人需对批次样品进行抽检质控亚硫酸盐转化效率，分别采用印记基因等不同甲基化程度的区域进行荧光定量PCR检测，检测不少于三个基因区域，并计算亚硫酸盐转化效率，确保其不低于98%；

3) 多余组织样本和提取物需返回给比选方；

4) 承诺：不瞒报、谎报、漏报检测数据、结果等信息；承担保密义务，不得泄露、擅自使用或对外发布检测结果和相关信息，严格遵守国家法律、法规和有关纪律要求。